Специализированное научно-практическое издания для ветеринарных врачей и студентов ветеринарных ВУЗов.

Авторы: Chiara Noli, Antonella Varina, Caterina Barbieri, Daniela Olivero.
Научное редактирование: Alessandro Gramenz, Andrea Boari.

Введение

Неблагоприятная пищевая реакция (adverse food reactions; AFR) и атопический дерматит собак (canine atopic dermatitis; CAD) являются распространенными дерматологическими заболеваниями у этого вида животных: по оценкам, ими может быть поражено до 30% всех собак¹. Основными симптомами AFR и CAD являются зуд; самоиндуцированная алопеция из-за расчесывания и трения; эритема морды, вентральных областей и конечностей; ссадины после расчесывания; также возможны отит, бактериальный и малассезиозный дерматиты как вторичные заболевания^2,3.
В настоящее время лучший способ дифференциации атопического дерматита и неблагоприятных пищевых реакций – это применение исключительно гипоаллергенной диеты в течение 8 недель^4,5. Гидролизованные диеты с крахмалом считаются наиболее надежными для этой цели, поскольку они состоят из очень коротких пептидов и аминокислот, не распознаваемых иммунной системой^6,7, в то время как диеты с ограниченным содержанием антигенов или диеты, содержащие цельные злаки, не являются столь эффективными из-за обширных перекрестных реакций между пищевыми аллергенами^8-10.
Диетический корм Farmina UltraHypo (FUH) оказался ценным средством диагностики AFR у собак¹¹.
Диагноз ставится путем наблюдения за улучшением кожных симптомов после 8-недельной диетотерапии и ухудшением кожных поражений и зуда после возобновления прежней диеты, вызывавшей аллергию у собак (провокационный тест). В исследовании с использованием FUH (Matricoti I., Noli C., 2018)¹¹ у значительного количества собак (60%) наблюдались существенные улучшения благодаря применению данной диеты, однако у многих из них (30%) не возникло рецидива при проведении провокационного теста, что позволяет предположить положительное действие диеты, выходящее за рамки коррекции пищевой аллергии.
Цель исследования: проанализировать микробиоту и микробиом кишечника у собак с аллергическими заболеваниями кожи, а также оценить изменения в кишечной микробиоте и метаболоме после двух месяцев применения FUH на фоне полученных клинических улучшений у животных с подтвержденным диагнозом AFR и у тех собак, у которых наблюдалось улучшение при соблюдении диеты, но не возникало рецидива после прекращения лечения (были отнесены к группе «сомнительный диагноз» – D), а также у собак с CAD.

Материалы и методы

Животные. В исследование, проведенное двумя ветеринарными дерматологами, были включены в общей сложности 40 собак с признаками кожной аллергии, с выявленным зудом и/или поражениями, совместимыми с несезонным аллергическим дерматитом, за исключением паразитарных заболеваний и кожных инфекций. Методы исследования были идентичны тем, которые описаны в вышеупомянутом исследовании¹¹.
Диета. Farmina UltraHypo – это коммерческий гипоаллергенный корм на основе гидролизованного рыбного белка (сельдь) и рисового крахмала с добавлением рыбьего жира сельди, который содержит 53,5% углеводов, 18% белков, 15% жиров, 1,2% клетчатки, 1,75% жирных кислот омега-3, 2,2% жирных кислот омега-6 и 2,05% линолевой кислоты. Он также содержит порошкообразную целлюлозу, хлорид калия, карбонат кальция, монокальцийфосфат, соль, добавки витаминов А, D3, Е и В12, аскорбиновую кислоту, ниацин, пантотенат кальция, рибофлавин, гидрохлорид пиридоксина, гидрохлорид тиамина, биотин, фолиевую кислоту, хлорид холина, бета-каротин, хелат гидрокси-аналога метионина цинка, хелат гидрокси-аналога метионина марганца, глицинат железа, хелат меди гидрокси-аналога метионина, инактивированные селеновые дрожжи, йодат кальция, DL-метионин, таурин и смешанные токоферолы (антиоксиданты).
Клиническая оценка. Оценку собак проводили во время фазы включения (V1) и через 8 недель использования FUH (V2)¹¹. Владельцы собак оценивали зуд по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) длиной 10 см с дескрипторами²⁸, а ветеринарные специалисты осуществляли оценку поражений с помощью индекса поражений при атопическом дерматите у собак (CADLI; диапазон 0–50)²⁹. В течение двух месяцев до и во время проведения исследования запрещалось применять системные антибиотики. Было разрешено назначение преднизолона в дозе 0,5–1 мг/кг в течение первых 10 дней и оклацитиниба – 0,4–0,6 мг/кг в течение первых 20 дней диеты, поскольку сообщалось о том, что оба препарата не влияют на микробиоту кишечника¹⁹.
Как только по оценке владельцев ВАШ и/или по результатам оценки поражения CADLI параметры по сравнению с V1 снижались как минимум на 50%, владельцам предлагалось провести провокационный тест (вернуть питомцу прежний рацион) для подтверждения диагноза AFR. В случае рецидива при применении предыдущей диеты с последующим новым улучшением при использовании элиминационной диеты у собак диагностировали AFR. У животных с уменьшением зуда и/или поражений менее чем на 50% признавали наличие не AFR, а CAD. Состояние собак, которое улучшалось, но не ухудшалось после провокации, было признано «сомнительным» (D).
Сбор и анализ фекалий. Фекалии всех собак собирали стерильным тампоном в дни V1 и V2 и хранили до обработки в консерванте Norgen's, предназначенном для сохранения фекальных мазков (Norgen Biotek, Торольд, Онтарио, Канада). Для выделения ДНК из образцов фекалий использовали набор той же фирмы. Извлеченную ДНК количественно определяли с помощью спектрофотометра и флуориметрии с использованием набора Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Гипервариабельную область V4 гена 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР. Последующий этап амплификации с ограниченным циклом был выполнен для добавления индексов мультиплексирования и адаптеров секвенирования Illumina (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).
Статистический анализ. Анализ альфа-разнообразия (внутри образца) и бета-разнообразия (между группами) состава микробиоты кишечника на основе данных OTU проводился для трех групп собак (AFR, CAD и D). Использовались три многомерные статистические модели: матрицы расстояний UniFrac (взвешенные и невзвешенные) по обилию OTU, а также матрицы Брея – Кертиса и анализ главных координат (PcoA) для образцов на оптимальной глубине разрежения. Программное обеспечение ANCOM-BC2 (анализ составов микробиомов с коррекцией смещения 2) использовалось для проведения дифференциального анализа данных о составе среди отдельных групп собак³⁴. Значимость была установлена на уровне p < 0,05.

Результаты

Собаки. В исследование были включены 40 собак (18 метисов и 22 чистокровные собаки), которые завершили 8-недельное испытание с применением диеты FUH. Средний возраст животных составил 4,8 года (диапазон: 8 месяцев – 12 лет). Всего было 19 самцов (один из которых был кастрирован) и 21 самка (девять стерилизованных). Средний вес составил 22,5 кг (диапазон 6–52 кг). Владельцы 30 из 40 собак сообщали о возникновении периодических или регулярных желудочно-кишечных расстройств, таких как рвота, срыгивание, диарея, мягкий кал, отрыжка, метеоризм или урчание. После завершения 8-недельной диеты у 9 из 40 собак улучшение состояния не наступило, и предполагалось наличие CAD. У 31 собаки были отмечены значительные улучшения, после чего им был проведен провокационный тест, после которого у 20 собак наблюдался рецидив клинических признаков, и поэтому был подтвержден AFR. У 11 собак после провокационного теста рецидива не возникло, и они были отнесены к группе «сомнительный диагноз».
Анализ микробиоты. Один образец из группы CAD перед диетой был непригоден для анализа из-за потери носителя во время транспортировки. Из оставшихся 79 образцов всего было получено 11 301 718 высококачественных демультиплексированных последовательностей с количеством прочтений от 49 181 до 304 681 на образец (медиана – 136 421, среднее – 143 060). Из секвенированных оснований 96,18% имели Q ≥ 30.
Не наблюдалось заметных различий в альфа-разнообразии микробиоты кишечника между образцами до применения диеты у трех групп собак с точки зрения равномерности, между образцами до и после диеты для каждой группы, ни между образцами после применения диеты (образцы рациона трех групп с учетом равномерности).

Многомерные сравнения состава микробиоты кишечника

Различия (бета-разнообразие) в составе кишечной микробиоты в образцах, взятых до и после соблюдения диеты, были подтверждены для трех групп собак. Анализ основных координат на невзвешенных (с учетом наличия/отсутствия OTU) и взвешенных (членство в сообществе и численность OTU) матрицах расстояний UniFrac выявил существенные различия в микробных сообществах у собак с AFR (p = 0,02) и собак с CAD (p = 0,018).
Пермутационный многомерный дисперсионный анализ (Adonis) показал, что тип диеты объясняет ~10% изменчивости бета-разнообразия. Никаких различий не наблюдалось у собак из группы D. Более того, не было обнаружено существенных различий между группами до и после применения диеты. Визуальный осмотр образцов отдельных собак, сгруппированных на графике PCoA, показал, что группы не объединяются.
На уровне типа в микробиоте у всех собак преобладали Bacteroidota (в среднем 42%), Fusobacteriota (в среднем 24,7%), Firmicutes (в среднем 22,9%) и Proteobacteria (в среднем 7,5%), хотя и с большими межиндивидуальными вариациями в относительной численности этих микробных таксонов. В образцах, полученных до использования диеты, Bacteroidota были в одинаковом количестве во всех группах (42–48%). Fusobacteria были более распространены у собак в группе AFR, чем в группах D и CAD, тогда как Firmicutes преобладали у собак в группе D. В образцах после соблюдения диеты количество Fusobacteria в целом оставалось неизменным, в то время как у собак из группы CAD количество Firmicutes увеличилось (p – значение 0,22), а количество Bacteroidota и Proteobacteria снизилось (p – значение 0,22). Количество Firmicutes также было снижено у собак группы D.
На уровне семейства доминирующими типами для всех собак были Bacteroidaceae (в среднем 25,9%), Fusobacteriaceae (в среднем 24,7%) и Prevotellaceae (в среднем 17,4%). В образцах, взятых до диеты, уровни Bacteroidaceae были выше, а Prevotellaceae –ниже у собак из группы CAD, тогда как в двух других группах они были одинаковыми. Уровни Fusobacteriaceae были выше в образцах, полученных до и после соблюдения диеты, у собак с AFR. В образцах после применения диеты количество Fusobacteriaceae незначительно увеличилось во всех группах, количество Bacteroidaceae слегка увеличилось у собак с AFR и D и снизилось у собак с CAD, в то время как обратное было верно для Prevotellaceae.
На уровне рода доминирующими у всех собак были Fusobacterium (в среднем 28,4%), Bacteroides (в среднем 23,9%), Fecalibacterium (в среднем 6,4%), Prevotella (в среднем 5,9%), Alloprevotella (в среднем 5%), Megamonas (в среднем 4,5%) и Sutterella (в среднем 3,1%). Только у собак с CAD в образцах, взятых после использования диеты, присутствовало 4,2% бактерий рода Collinsella.
В образцах, взятых до диеты, представители рода Prevotella встречались гораздо реже у собак с CAD по сравнению с собаками из групп AFR и D (6% против 14,5–18,5%), в то время как Bacteroides были более распространены (34,3 против 19%). После соблюдения диеты количество Fusobacterium немного увеличилось во всех группах, количество Prevotella снизилось, а количество Bacteroidetes увеличилось у собак из групп AFR и D в отличие от собак с CAD, у которых количество Bacteroides снизилось. Таким образом, значимое для микробиома кишечника здоровой собаки соотношение Prevotella + Bacteroides/Fusobacterium³⁵ существенно уменьшилось во всех группах.
Оценка различий в бактериальном составе с помощью LefSe показала, что в трех группах было обнаружено обогащение нескольких бактериальных таксонов. После использования диеты в группе AFR микробиота обогатилась двумя новыми классами (Vampirivibrionia и Bacilli), четырьмя отрядами, шестью семействами бактерий и девятью родами бактерий, включая Clostridium UCG 14 (p = 0,03), Paraprevotella (p = 0,04), Roseburia (p = 0,03), Parabacteroides (p = 0,001), Erysipelatoclostridium (p = 0,02), Bacillus (p = 0,04), Lachnospira (p = 0,01) и Epulopiscium (p = 0,04).

Анализ метаболических путей: функциональные изменения микробиоты кишечника

После потребления FUH в течение 8 недель у всех собак снизились пути метаболизма углеводов (p = 0,01), а также наблюдались следующие изменения:

У собак с CAD:

Значительная коррекция дефицита (до диеты) гликосфинголипидного пути после применения диеты (p = 0,02).
Увеличение биосинтеза гликанов после применения диеты (p = 0,04).
Коррекция дефицита апелина по мере использования диеты (p = 0,02).
Увеличение нуклеозидов и нуклеотидов и их биосинтеза после применения диеты (p = 0,04).
Увеличение биосинтеза жирных кислот и липидов после применения диеты (p = 0,03).

У собак с AFR:

Снижение биосинтеза липидов после применения диеты (р = 0,04).
Увеличение метаболических путей гликолиза фруктозы после применения диеты (p = 0,02).
У собак из группы D после применения диеты наблюдалось увеличение биосинтеза аминов и полиаминов (p = 0,03).

Обсуждение

Это первое исследование, в ходе которого проводился анализ изменения фекальной микробиоты у собак с кожной аллергией, получавших диету на основе гидролизованного рыбного белка и рисового крахмала.
В связи с тем что образцы были взяты только у животных с зудом (в исследование не были включены здоровые животные), нет данных о том, отличалась ли микробиота в этой популяции от микробиоты у здоровых собак. Rostaher A. и др.¹⁹ не обнаружили существенной разницы на уровне типа между собаками с атопическим дерматитом (CAD) и здоровыми животными, однако сообщили о значительном снижении количества семейств Anaerovoracaceae, Ruminococcaceae и Peptostreptococcaceae у собак с CAD по сравнению со здоровыми собаками. В наших образцах процентное содержание Anaerovoracaceae и Peptostreptococcaceae было аналогично результатам, полученным в исследовании (Rostaher A.) собак с атопическим дерматитом¹⁹, однако уровни Ruminococcaceae были выше у всех наших собак с аллергией. На уровне рода Rostaher A. с соавтор. обнаружили, что количество Catenibacterium увеличивается у собак с атопией¹⁹. Этот род (хотя и в небольших количествах) наблюдался во всех наших исследовательских группах со значительным уменьшением количества образцов после использования диеты.
Никаких существенных различий (бета-разнообразие) между группами в образцах перед использованием диеты не отмечалось. В целом у собак с CAD наблюдалось меньшее количество представителей типа Firmicutes и рода Prevotella и более высокое количество представителей типа Bacteroidetes и семейства Bacteroides. Firmicutes играют важную роль во взаимосвязи между кишечными бактериями и здоровьем. Многие представители этого типа расщепляют сложные углеводы, такие как пищевые волокна, не перевариваемые кишечником, и резистентный крахмал с образованием короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), включая пропионат, ацетат и бутират, которые помогают предотвратить воспаление и улучшают метаболизм колоноцитов¹³.
Источником углеводов FUH является рисовый крахмал (резистентный крахмал; RS). Доказано, что RS – пищевая клетчатка, которая обладает многочисленными преимуществами для здоровья, в частности, снижает риск развития хронических заболеваний, таких как ожирение и диабет. Это благоприятное воздействие можно объяснить изменениями в популяции кишечных бактерий и выработкой микробных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), особенно бутират и ацетат⁴³. Колоноциты, как правило, используют бутират в качестве основного источника энергии, тогда как ацетат и пропионат транспортируются в печень через воротную вену. В печени пропионат метаболизируется для глюконеогенеза, а ацетат служит субстратом для синтеза холестерина и липогенеза. Кроме того, ацетат поглощается мышечной и жировой тканью. Результаты данного исследования показали, что диета с высоким содержанием RS приводит к увеличению производства бактерий, продуцирующих КЦЖК (такие как Bacteroides), в содержимом просвета кишечника. Однако этот эффект наблюдался только у собак с AFR и D.
В рационе Farmina UltraHypo источником белка является гидролизованная рыба, состоящая из небольших пептидов или отдельных аминокислот, которые снижают вероятность иммунного ответа на белковые компоненты рациона. Несмотря на 8-недельный курс диеты исключительно на основе гидролизованного белка, бактериальное разнообразие, по-видимому, не пострадало, поскольку не наблюдалось значительных изменений индекса Шеннона. Аналогичный результат был получен и в других исследованиях, где рацион здоровых собак в течение как минимум 4 недель состоял из кормов с гидролизованным белком/кристаллизованными аминокислотами и крахмалом^26,31.
Напротив, анализ различий микробиоты (бета-разнообразия) между образцами до и после диеты выявил значительные различия для групп AFR и CAD. В образцах после применения диеты во всех группах наблюдалось снижение численности бактерий типа Bacteroidetes, причем снижение было обусловлено группой Bacteroides. Количество бактерий типа Firmicutes значительно увеличилось только у собак с CAD, тогда как количество протеобактерий семейства Enterobacteriaceae у них было снижено (p = 0,22).
Обогащение микробиоты является ключом к улучшению состояния кожи при атопическом дерматите, и вполне возможно, что это справедливо также в отношении микробиоты кишечника⁴⁶. Таким образом, собаки с CAD могут получить пользу от пробиотиков для улучшения состояния кожи, как уже предполагалось в ранних исследованиях, проведенных Marsella с соавторами^24,25.
В нашем исследовании наблюдался дефицит апелина у собак с атопическим дерматитом до диетического вмешательства. Апелин действует как эндогенный лиганд для рецептора APJ (семи-трансмембранного рецептора, связанного с G-белком). Апелиновые и APJ-рецепторы распределены в различных тканях, включая сердце, легкие, печень, почки и ЖКТ. В нормальных условиях система «апелин/APJ» играет разнообразные биологические роли, такие как секреция желудочной кислоты, контроль аппетита, пролиферация и апоптоз клеток, секреция CCK, высвобождение гистамина, секреция сока поджелудочной железы, моторика желудочно-кишечного тракта и регуляция оси «кишечник – мозг».
У собак с CAD до диетического вмешательства наблюдался дефицит гликосфинголипидных путей, показатель которых значительно увеличился после соблюдения диеты. Недавние исследования показали, что сфинголипиды и ферменты, участвующие в их метаболизме, могут играть роль в развитии аллергических заболеваний. Сфинголипиды имеют решающее значение для роста клеток, их выживания, воспаления и ремоделирования тканей. Снижение или изменение состава сфинголипидов в эпидермисе способствует не только нарушению барьерной функции кожи, но и развитию воспалительных и аллергических свойств у пациентов с атопическим дерматитом⁴⁸.
Сфинголипиды кишечника хозяина помогают сохранять виды Bacteroides или регулировать их численность посредством бактерицидной активности сфингозина. Напротив, неконтролируемая пролиферация патогенных бактерий, таких как Pseudomonas, Staphylococcus или Mycobacterium, может нарушить баланс бактериальной флоры и препятствовать метаболизму сфинголипидов хозяина⁵¹. В данном исследовании после диетического вмешательства наблюдалось увеличение количества видов Bacteroides у собак с AFR и D, в то время как у собак с CAD наблюдалось снижение уровней Bacteroides.
У собак с AFR после соблюдения диеты наблюдалось увеличение метаболического пути гликолиза за счет фруктозы и обогащение Bacilli, Roseburia, Parabacteroides, Lachnospira, Erysipelatoclostridum, Clostridium UCG 14 и бактериями класса Vampirivibrio. Фруктолиз – процесс, аналогичный гликолизу, – использует многие из тех же ферментов и метаболических промежуточных продуктов.
Результаты этого метагеномного исследования демонстрируют, что у собак в группе AFR после применения диеты FUH повышается способность утилизировать сахара за счет улучшения метаболических процессов и что органические компоненты рациона обеспечивают благоприятный субстрат для роста бактерий, продуцирующих бутират и ацетат. Одна из возможностей заключается в том, что метаболизм фруктозы может дать большее преимущество бациллам и кишечным бактериям, продуцирующим бутират и ацетат. Действительно, микробы зависят от своего сообщества, которое поддерживает всю биологическую активность, необходимую для их метаболизма.

Выводы

Полученные предварительные данные позволяют предположить, что патологические изменения в микробиоте и метаболоме у собак с аллергией корректируются посредством использования диеты FUH, и, возможно, это может привести к клиническому улучшению дерматологических симптомов.
Диетический корм FUH, содержащий рисовый крахмал, модифицирует микробиоту, способствуя росту бактерий, которые производят короткоцепочечные жирные кислоты, важные для сохранения целостности кишечного эпителиального барьера и повышения активности колоноцитов. Диета FUH также снижает распространенность типа бактерий Bacteroidetes, характерного для собак с дисбиотическими нарушениями, и бактерий Prevotella, которые обычно встречаются при хронических кишечных заболеваниях.

Полная версия статьи и список литературы: