- Tyrus Veterinary Clinic, Via A. Bartocci 1/G, 05100 Terni, Italy; riccardo.orlandi83@hotmail.it (R.O.); manu0391@libero.it (E.V.)
- Department of Veterinary Medicine and Animal Production, University of Napoli Federico II, 80100 Napoli, Italy; serena.calabro@unina.it (S.C.); alessandro.vastolo@unina.it (A.V.); pietro.lombardi@unina.it (P.L.); monica.cutrignelli@unina.it (M.I.C.)
- School of Bioscience and Veterinary Medicine, University of Camerino, 62024 Matelica, Italy; alessandro.troisi@unicam.it
- Department of Veterinary Medicine, University of Perugia, 06124 Perugia, Italy; angela.polisca@unipg.it
Введение
Репродуктивная способность является ключевым аспектом всех размножающихся видов. Множество факторов, таких как инфекционные заболевания, гормональный и пищевой статусы, могут повлиять на фертильность самок. Основополагающее значение при этом имеют большое количество новорожденных в помете, правильное развитие плода, пищевой статус при спаривании и правильное питание во время беременности. Питание играет решающую роль в удовлетворении метаболических потребностей во время беременности. Рацион должен обеспечивать достаточное количество энергии и питательных веществ для удовлетворения потребностей матери, а также потребностей растущего плода и позволять матери создавать запасы питательных веществ для развития плода и лактации1. Незаменимые жирные кислоты, витамины и минералы (особенно кальций, фосфор и магний) играют важную роль в выработке гормонов яичников, развитии плаценты и плода и при правильном балансе с другими микро- и макроэлементами могут улучшить раннюю выживаемость эмбриона, размер помета, лактацию и выживаемость новорожденных4,5.Цели данного исследования: сравнение двух полноценных рационов, различающихся по составу ингредиентов и питательным веществам (назначались сукам среднего и крупного размера за 2 месяца до ожидаемого начала проэструса и наступления родов)8,9 и описание влияния эструса на вагинальную цитологию, развитие фолликулов и течение беременности.
Материалы и методы
Все процедуры, использованные в исследовании, были одобрены Этическим комитетом по уходу за животными и их использованию Неаполитанского университета им. Федерико II в соответствии с местными и национальными законодательными нормами и рекомендациями (Dlgs 26, 4 марта 2014 г.).Восемнадцать многородящих сук (в среднем – 1,5 предыдущих беременностей) среднего и крупного размеров были отобраны для участия в исследовании. Были представлены следующие породы собак: бернский зенненхунд, французский бульдог, английский бульдог, доберман, аргентинский дог, питбуль, немецкий дог, золотистый ретривер, ховаварт, лабрадор-ретривер, немецкая овчарка и уиппет. Все животные были признаны здоровыми на основании обычного клинического осмотра и гематологических исследований. Согласно клиническому анамнезу каждой собаки, интервалы между эструсами предыдущих циклов были сочтены нормальными. Все суки имели доказанную фертильность с историей предыдущих нормальных беременностей, получили отрицательный результат анализа на наличие бруцеллеза и были вакцинированы от герпесвируса.
Собаки были поровну разделены на две группы (по 9 сук), и каждой группе назначался один из двух рационов – контрольный (CTR) и экспериментальный (EX), которые различались соотношением ингредиентов (источники крахмала и белка), уровнем энергии, содержанием белка и фолиевой кислоты (табл. 1).
- CTR: мука из птицы, рис, кукуруза, птичий жир, рыбная мука, свекловичный жом, рыбий жир, растительное масло, хлорид натрия и обезвоженный дрожжевой экстракт – Saccharomyces cerevisiae.
- EX: мука из птицы, спельта, овес, картофель, рыбная мука, гидролизованный рыбный белок, свекловичный жом, дегидрированные яйца, рыбий жир, льняное семя, карбонат кальция, монокальцийфосфат, калия хлорид, растворимая клетчатка (подорожник), МОС, хлорид натрия и обезвоженный дрожжевой экстракт – Saccharomyces cerevisiae.
Обе диеты были дополнены смесью витаминов и микроминералов в пропорции, соответствующей их специфическим энергетическим уровням, а также различными уровнями фолиевой кислоты (CTR – 12,84 и EX – 13,14 мкг/МДж ME). Оба рациона произведены компанией Farmina Pet Foods (Нола, Италия): первый – коммерческий сухой корм, разработанный для взрослых собак, а второй был разработан специально для проведения исследования.
Экспериментальные группы были распределены следующим образом:
- Контрольная группа (CTR) состояла из четырех сук среднего размера и пяти сук крупного размера (масса тела – 31,94 кг ± 13,08; BCS по 5-балльной шкале – 3,30 ± 0,26);
- Экспериментальная группа (EX) состояла из двух сук среднего размера и семи сук крупного размера (масса тела – 29,08 кг ± 14,35; BCS по 5-балльной шкале – 3,63 ± 0,52).
Наблюдение за суками до установления диагноза беременности.
Владельцам было поручено за два месяца до ожидаемого начала проэструса и до отъема щенков один раз в неделю (в домашних условиях) проводить измерение некоторых параметров у сук: частоту сердечных сокращений и дыхания, ректальную температуру. С момента появления серозно-геморрагических выделений из вульвы, указывающих на начало проэструса, цикл контролировали в ветклинике с помощью кольпоцитологии, измерения сывороточного прогестерона и УЗИ яичников. Спустя 48 часов после овуляции сук вязали дважды с интервалом в 24 часа.
Вагинальная цитология и определение прогестерона в плазме.
У каждой суки с момента начала проэструса брали вагинальные мазки из краниального отдела влагалища каждые 3 дня до дня овуляции и сразу исследовали с использованием окрашивания гематоксилин-эозином11. Оценку мазков из влагалища выполняли с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse E200 (Nikon Instrument Europe Amstelveen, Амстердам, Нидерланды) при увеличении от 100× до 400× (Antonov A. L.)12. При этом концентрацию прогестерона в сыворотке определяли с помощью ферментативно-связанного флуоресцентного анализа (MiniVIDAS Biomerieux, Marcy L'etoile, Франция). Согласно другому исследованию (Concannon P.W.)13, время овуляции определяли по повышенной концентрации прогестерона (т. е. > 5 нг/мл) и преобладанию поверхностных клеток в вагинальной цитологии.
Ультразвуковое сканирование.
Все ультразвуковые исследования проводились на аппарате GE Logiq E9 (GE Medical Systems, Милуоки, Висконсин, США) без седации и в положении животных лежа на правом боку. С начала проэструса для оценки яичников УЗИ проводили каждые 3 дня до дня овуляции с целью оценки развития фолликулов: гонады были обнаружены позади каудального полюса гомолатеральной почки, количество и размер фолликулов были записаны. Время овуляции определяли с момента появления первых признаков разрыва фолликулов, сравнивая результаты УЗИ (Fontbonne A.)14. Спустя 18 дней после овуляции УЗИ проводилось 2 раза в неделю в течение всего периода беременности вплоть до родов. При каждом обследовании для оценки жизнеспособности и развития эмбриона/плода учитывали следующие параметры: внутренний диаметр хориальной полости, теменно-копчиковый размер (расстояние в длину от верхушки черепа до корня хвоста) и диаметр тела, бипариетальный диаметр, частота сердечных сокращений плода и внешний вид органов эмбриона/плода в фазу гестации (рис. 1).
Контроль веса и окислительный статус.
Масса тела сук и их упитанность (BCS, шкала 5 баллов) измерялись в начале отбора животных в исследование, а затем еженедельно. При отборе для участия в исследовании у сук брали кровь для оценки следующих показателей: азота мочевины, креатинина (CREA), глюкозы (GLU), общего белка (TP), альбумина (ALB), билирубина (BIL), аспартатаминотрансферазы (AST), аланинаминотрансферазы (ALT), гамма-глутамилтрансферазы (GGT), холестерина (CHO) и триглицеридов (TRI), хлора (Cl), натрия (Na), кальция (Ca) и фосфора (P). Биохимическое исследование проводилось с помощью автоматического биохимического анализатора (AMS AUTOLAB, Рим, Италия) с использованием реагентов Spinreact (Санта-Колома, Испания). Кроме того, образцы крови были собраны в момент установления факта беременности для оценки активных метаболитов кислорода (тест d-ROMs) и потенциала биологических антиоксидантов (тест BAP) на образцах сыворотки, которые измерялись с использованием реагентов, утвержденных для собак (Diacron International s.r.l. Гроссето, Италия).
Статистический анализ с помощью однофакторного дисперсионного анализа согласно следующей модели:
Yijk = µ + Ti + Sj + (T × S)ij + εijk, где Y – зависимая переменная, µ – среднее значение, T – эффект лечения (i: CTR, EX), S – эффект размера собаки, j: средний (масса тела < 30 кг) и крупный (масса тела > 30 кг), T × S – первый уровень взаимодействия, ε – эффект ошибки.
При обнаружении существенных различий в дисперсионном анализе средние значения сравнивались с использованием теста Тьюки. Данные о резорбции эмбриона и размере приплода анализировали с применением непараметрического критерия Уилкоксона. Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения JMP 14 (SAS Institute, Северная Каролина, США).
Результаты
Наблюдение за суками до установления диагноза беременности.Диетотерапия влияла лишь на некоторые параметры УЗИ яичников и цитологии влагалища. Во время эструса и овуляции длинная ось яичников была достоверно выше (p < 0,05) в группе EX по сравнению с группой CTR. Та же тенденция (p < 0,05) наблюдалась в отношении фолликулов в яичниках во время эструса. В период эструса в опытной группе (EX) определялись достоверно повышенные значения (p < 0,05) прогестерона и процент поверхностных клеток. Размер сук значимо (p < 0,05) влиял лишь на некоторые параметры. В частности, суки среднего размера показали более высокие значения короткой оси яичников и уровня прогестерона во время проэструса. Во время течки у сук крупного размера отмечался достоверно (p < 0,05) более высокий процент поверхностных клеток, чем у сук среднего размера.
Сравнительная характеристика скорости эмбрионального роста в зависимости от питания и размера сук:
- Внутренний диаметр полости хориона. В группе EX зафиксированы более высокие значения, чем в группе CTR, в частности на 23-й день разница была достоверной (1,30 против 0,80 см; p < 0,05). Данный показатель также был выше у сук более крупных размеров (на 23-й день – 1,27 против 0,83 см; p < 0,05) по сравнению с животными среднего размера.
- Бипариетальный диаметр. Оба показателя (диета и размер) не повлияли на этот параметр, за исключением 37-го дня, когда значение диаметра в группе CTR было значительно выше (1,36 против 1,13 см, p < 0,05), чем в группе EX.
- Диаметр тела плода. В контрольной группе по сравнению с экспериментальной были отмечены более высокие значения, хотя разница оказалась значимой только на 41-й день (1,91 против 1,61 см, р < 0,05). Крупные собаки до 46-го дня демонстрировали больший диаметр по сравнению с суками среднего размера, а с 46-го дня значения стали схожими.
- Теменно-копчиковый размер. В группе CTR этот показатель был выше в течение первых 50 дней беременности (50-й день: 10,74 против 9,75 см, p < 0,05), затем значения стали перекрываться. Эмбрионы у крупных сук всегда были длиннее, чем у сук среднего размера.
Клиническая оценка частоты дыхания, сердечных сокращений и ректальной температуры соответствовала норме у всех испытуемых в течение всего периода исследования. Различий между группами по массе тела сук после родов не было обнаружено (32,56 кг против 39,73 кг для CTR и EX соответственно), несмотря на то, что BCS в конце беременности (p < 0,001) был значительно выше у собак в группе EX (3,42/5), чем в группе CTR (2,75/5).
На окислительный статус, который измерялся с момента подтверждения факта беременности у собак, влияли как режим питания, так и размер животного: в частности, полученные значения d-ROMs были выше (p < 0,01) в группе CTR, чем в группе EX, и у сук среднего размера по сравнению с крупными (p < 0,05). Во всяком случае, существенных различий не отмечалось в значениях BAP, даже если тенденция была противоположной той, которая наблюдалась в отношении теста d-ROM.
Обсуждение результатов
Плохое питание (дефицит или избыток) неблагоприятно сказывается на беременности даже у здоровых животных. Сбалансированный рацион может улучшить раннюю эмбриональную выживаемость, увеличить размер и вес помета при рождении и способствует выживаемости новорожденных6,7.В целом как в экспериментальной, так и в контрольной группе сук фолликулярная фаза протекала нормально. Показатели массы и состояния тела всех собак находились в пределах относительного физиологического диапазона для данного вида животных в период беременности и с учетом увеличения веса перед родами на 15–25% от исходной массы тела2,4,5. С клинической точки зрения, большое количество поверхностных клеток и высокий уровень прогестерона, выявленный в группе EX во время эструса, делают эту фазу более типичной и цитологически легко распознаваемой18. Более того, большее количество преовуляторных фолликулов, обнаруженное у сук, получавших рацион EX, предполагает потенциальное повышение фертильности, связанное с более высокими дозами макро- и микроэлементов. Тенденцию подтвердило большее количество щенков в помете, зарегистрированное в группе EX по сравнению с CTR. В этом исследовании не было выявлено значительного влияния природной принадлежности и разницы в размерах самок на частоту резорбции плода в отличие от данных, опубликованных L. Sharma и др.19. Кроме того, наличие различных питательных веществ в составе рационов, вероятно, могло повлиять на выявленные в данном исследовании существенные различия (p < 0,05) между группами по числу поверхностных клеток влагалища (76,8% против 67,0% для групп EX и CTR соответственно) и в размерах помета (9,11 и 3,89 для групп EX и CTR соответственно). В любом случае резорбция плода и число щенков в помете, зарегистрированное в обеих группах, находились в физиологических пределах, установленных для этого вида, что указывает на адекватное содержание питательных веществ в диетах EX и CTR21.
Прогестероновый профиль в течение фолликулярного периода был нормальным, а разница внутри групп, отмеченная в начале эструса, может быть связана с широкой изменчивостью повышения уровня этого гормона17. В данном исследовании была зафиксирована достоверная (p < 0,05) разница уровней прогестерона в проэструс между суками средних и крупных размеров, что входит в противоречие с опубликованными данными (Hollinshead F. K., Hanlon D. W.)22 Лучший репродуктивный результат, зафиксированный в группе EX, может быть связан с более высоким содержанием незаменимых жирных кислот (НЖК) в рационе. При недостатке НЖК у сук отмечаются нарушения репродуктивной функции, а у новорожденных – аномалии почек и печени; по этой причине НЖК должны присутствовать в рационе беременных собак для обеспечения выработки гормонов и развития яйцеклеток23,24. У собак линолевая (ЛК, C18:2 n6) и α-линоленовая (АЛК, C18:3 n3) кислоты считаются незаменимыми, потому что они не синтезируются в организме и, следовательно, животные должны получать их вместе с рационом.
Учитывая одинаковое содержание жира в рационах, предназначенных для групп EX и CTR в этом исследовании, кажется возможным, что хорошие результаты, полученные в группе EX, могут быть связаны с наличием линолевой и альфа-линоленовой кислот. Действительно, диета CTR характеризовалась более высоким соотношением ЛК:АЛК (29,87 против 16,44 в группах CTR и EX соответственно; NRC10 рекомендуется соотношение ЛК:АЛК между 2,6 и 16,0).
В первой трети беременности диаметр плодных пузырей был больше в группе EX, что свидетельствовало о более быстром темпе раннего эмбрионального роста. Эти результаты могут быть связаны с более высоким содержанием белка в диете EX по сравнению с CTR (17,90 и 19,73 г/МДж ME)24.
Процент резорбции плода во время беременности был ниже в экспериментальной группе (11,94% против 7,5% для группы CTR и EX соответственно), а общий процент гибели плода варьировался от 10 до 15%, что соответствует более низким значениям, опубликованным в литературе25,26. Принимая во внимание тот факт, что выживаемость эмбрионов/плодов напрямую зависит от удовлетворения высоких потребностей беременных самок в энергии, белке и витаминах27, можно утверждать, что низкий процент резорбции плода в группе EX был связан с рационом, даже если не удалось точно определить, какие питательные вещества (например, сырой протеин, LA:ALA, фолиевая кислота) играют решающую роль. Поскольку рационы различаются по содержанию белка (27–34% в зависимости от корма) и аминокислотному профилю, беременным сукам рекомендуются рационы, в которых содержание белков животного происхождения составляет 29–32%28. Точно так же общее содержание жира и профиль жирных кислот влияют на частоту наступления беременности, размер помета и количество новорожденных. И наоборот, ожирение способствует развитию дистоции и повышенной неонатальной смертности15. Несмотря на то что содержание кальция и фосфора в опытном рационе было вдвое больше, чем в контрольном корме, не было выявлено существенных различий в показателях уровня кальция и фосфора в сыворотке крови между группами. Вероятно, это было связано с наложением соотношения Ca:P в рационах и/или с высокой способностью сук регулировать депонирование и мобилизацию кальция для производства молока29. С учетом того, что в этом исследовании наблюдения ограничивались биохимическим анализом крови, нельзя исключить появление костной деминерализации из-за резкого повышения потребности в кальции в начале лактации.
Показатели окислительного статуса в группе EX демонстрировали более низкие значения по сравнению с CTR, что указывает на общее снижение активных форм кислорода30. Этот результат может быть связан с диетическими факторами, участвующими в предотвращении негативных последствий окислительного стресса, такими как технологии производства и условия хранения кормов, использование антиоксидантных добавок32. Оба рациона, используемых в эксперименте, были дополнены токоферолами в качестве антиоксидантов. В экспериментальном рационе были выявлены более высокие концентрации ЛК, АЛК, эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой (ДГК) кислот. Возможно, это было связано с наличием в рационе EX семян льна, которые богаты линолевой, α-линоленовой кислотами и γ-токоферолом, защищающими клетки от окисления33.
Выводы
Можно отметить, что введение экспериментального рациона (EX) позволило улучшить клиническую картину течки, увеличить количество фолликулов у животных, обеспечить более быстрый темп раннего эмбрионального роста, снизить процент резорбции плода и увеличить размер помета.Несмотря на неоднородное распределение между группами сук крупного и среднего размера в данном исследовании, полученные результаты подтверждают, что рацион, характеризующийся различным распределением белков, жиров и углеводов, и богатый незаменимыми жирными кислотами, может улучшить репродуктивную функцию собак. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше изучить взаимодействие между различными компонентами рациона в период беременности у собак.
Полная версия статьи и список литературы.
vetpeterburg