Кафедра зоотехнических наук и исследований продуктов, Неаполитанский университет им. Федерико II, Неаполь, Италия
Исследований нормальной кишечной микробиоты у собак было опубликовано мало в отличие от большого количества информации, касающейся различных видов сельскохозяйственных животных. Метод выделения газа in vitro (in vitro gas production technique; IVGPT), включающий измерение накопления газа в процессе ферментации и определение конечных продуктов, позволяет получить полную картину кинетики микробной активности. Большая популяция микроорганизмов, характеризующаяся высокой плотностью и широким разнообразием, обитает в кишечнике и образует тесно интегрированную экологическую единицу с хозяином. Эту сложную смешанную микробную культуру можно рассматривать как наиболее метаболически адаптируемый и быстро возобновляемый орган (Simpson et al., 2002). Микробное сообщество кишечника играет жизненно важную роль в физиологических процессах, пищевых и иммунологических функциях организма (Mackie et al., 1997).
Большая часть исследований фекальных бактерий у собак была проведена с участием представителей породы бигль, значительно меньше информации имеется о собаках других пород. С другой стороны, схема классификации, основанная на филогенезе, была признана недавно, и большая часть знаний о популяциях кишечных бактерий была описана с использованием косвенных микробиологических методов, таких как чашечный метод выборочного подсчета, селективное обогащение, выделение чистой культуры. Наиболее полное исследование касается характеристики бактериальной популяции собачьих фекалий у трех пород собак (немецкая овчарка, английский сеттер и цвергшнауцер) с использованием не только методов культивирования, но и молекулярных методов (Simpson et al., 2002).
Метод выделения газа in vitro (IVGPT), предложенный группой исследователей (Theodorou et al., 1994), измеряет кинетику ферментации и может использоваться для оценки активности микробных популяций (Williams et al., 2001). IVGPT включает измерение аккумулирующегося газа во время ферментации для оценки микробной активности популяции в целом. В конце периода ферментации берут пробы для измерения конечных продуктов (летучих жирных кислот [ЛЖК], других газов [NH3]) и утилизации субстрата. Данный метод осуществляется в строго анаэробных условиях и используется для оценки активности микрофлоры из множества различных источников, включая рубец (Calabro` et al., 2004; Cutrignelli et al., 2007), различные отделы желудочно-кишечного тракта свиней (Williams et al., 1997), кроликов (Bovera et al., 2008 a, b), слепую кишку домашней птицы (Williams et al., 1995; Bovera et al., 2007) и фекалии собак (Cutrignelli, 2006). Использование различных субстратов дает возможность отслеживать изменения в микробных популяциях, связанные с ферментацией конкретного корма.
В одной публикации (Drasar, 1988) фекалии были описаны как отработанная культуральная среда ферментера толстой кишки. Его изучали, поскольку он легкодоступен и является исходным материалом для основных групп кишечных бактерий, который можно брать у одного и того же хозяина в разное время. В ходе детальных исследований количества микроорганизмов (Moore et al., 1978) авторы пришли к выводу, что состав бактериальной флоры фекалий напоминает состав бактерий толстого кишечника, а свежие фекалии, собранные в строго анаэробных условиях, можно рассматривать как репрезентативную флору толстого кишечника. В отношении ЛЖК и кумулятивного газообразования были обнаружены некоторые различия между инокулятами слепой кишки и фекалий (Williams et al., 1997), однако был сделан вывод о том, что фекалии, тем не менее, дают достаточную оценку активности в верхнем отделе слепой кишки.
Цель данного исследования: изучение ферментативных характеристик различных источников углеводов методом IVGPT с использованием инокулята фекалий собак пород немецкая овчарка (GS) и неаполитанский мастиф (NM).
Материалы и методы
Испытание проводилось с участием двух 3-летних собак породы немецкая овчарка (GS) и двух 3-летних собак породы неаполитанский мастиф (NM). Средняя масса тела животных составила 32,5 кг и 59,8 кг для GS и NM соответственно. Собак, выращенных в одном и том же питомнике, кормили (140 ккал МЕ/кг0,75) коммерческим сухим кормом (сырой протеин – 25,8%; общее количество пищевых волокон – 6,6%). После 20 дней адаптации образцы фекалий собирали ректально в анаэробных условиях и немедленно доставляли в лабораторию.Образцы фекалий разбавляли (1:10) раствором NaCl, гомогенизировали, фильтровали и инкубировали при 39 °С в анаэробных условиях в флаконах с сывороткой емкостью 120 мл (Bauer et al., 2001). Газообразование ферментирующих культур регистрировали 17 раз (с интервалом 2–4 ч) с помощью ручного датчика давления. Ферментацию останавливали через 48 ч и ферментационную жидкость анализировали на pH (стеклянный электрод Alessandrini Instrument, модель 3030; Jenway, Данмоу, Великобритания) и ЛЖК. Для определения ЛЖК образец дважды центрифугировали при 12 000 × g в течение 10 мин при температуре 4 °С, отбирали 1 мл надосадочной жидкости и смешивали с 1 мл щавелевой кислоты (0,06 моль). ЛЖК измеряли с помощью газовой хроматографии (ThermoQuest Italia SpA, модель 8000top; Родано, Милан, Италия, капиллярная колонка из плавленого кварца 30 м × 0,25 мм × толщина пленки 0,25 мкм), сравнивая площади пиков образцов каждого ЛЖК с соответствующей площадью внешнего стандарта, состоящей из ацетата, пропионата, бутирата, изобутирата, валерата и изовалерата (Calabro` et al., 2006).
Количество исчезнувшего органического вещества (organic matter disappearance; OMD) определяли посредством фильтрования под вакуумом на предварительно взвешенных стеклянных тиглях (Scott Duran, пористость № 2) остатков ферментации, которые сушили при 103 °С и сжигали остаток при 550 °С. Усвояемость органических веществ (OMD) рассчитывали как разницу после сжигания остатков. Объемы газа, зарегистрированные во время ферментации, были связаны с количеством инкубированного органического вещества (organic matter cumulative volume; OMCV).
Профили газа были подогнаны под модель, описанную (Groot et al., 1996) следующим образом: G = A/[1+ (B/t)C], где G – общее количество выделяемого газа (мл/г), A – асимптотическое выделение газа (мл/г), B – время, в течение которого половина асимптоты достигнута (h), C – характеристика переключения кривой и t – время (ч).
Максимальная скорость ферментации (Rmax) и время, в течение которого это происходит (Tmax), также рассчитывали по следующим формулам (Bauer et al., 2001):
Были использованы девять субстратов, представляющих углеводы с различными характеристиками ферментации: рис (R), кукуруза (С), спельта (S), картофель (P), свекольный жом (BP), отруби пшеничные (WB), фруктоолигосахариды (FOS), инулин (I) и чистая целлюлоза (PC). Перед испытанием все субстраты были проанализированы на химический состав (AOAC 2006), крахмал определяли с помощью поляриметра (Polax-L, модель PX-L, ATAGO Co, LTD, Токио, Япония) (Martillotti et al., 1987).
Характеристики ферментации и подобранные параметры были подвергнуты дисперсионному анализу (процедура GLM SAS 2000) для определения породы (MN и GS) и субстрата (R, C, S, P, BP, WB, FOS, I и PC), в модель было включено взаимодействие «порода – субстрат». Коэффициенты корреляции Пирсона между химическим составом и параметрами in vitro, а также среди параметров ферментации изучали с использованием процедуры CORR в SAS (2000).
Результаты
В табл. 1 приведен химический состав субстратов. В целом химический состав девяти субстратов согласуется с библиографическими данными (INRA, Institut National de la Recherche Agronomique, 1987; Martillotti et al., 1989; Piccioni, 1989).
Как и ожидалось, на параметры IVGPT значительное влияние оказывает химический состав субстратов: OMD достоверно (p < 0,01) выше для фруктоолигосахаридов (FOS) и инулина (99,14 и 94,89% соответственно), а наименьшее значение дает целлюлоза (2,50%). Субстраты, более богатые крахмалом (кукуруза (C), рис (R), картофель (P), спельта (S)), показали самые высокие значения OMCV. Относительно параметров математической модели рис, кукуруза, спельта и картофель показали достоверно более высокие значения А, В, С и Tmax, чем инулин и FOS, а последние характеризовались достоверно (p < 0,01) более высокими значениями Rmax.
Что касается сравнения между породами, инокулят, взятый у NM (немецкие овчарки) дал значительно более высокие (p < 0,01) значения OMD (74,48 против 72,17%), B (16,15 против 12,56 ч), C (2,45 против 2,15) и Tmax (10,50 против 7,82 ч) и более низкое значение OMCV (138,9 против 157,6 мл/г), чем у GS (неаполитанские мастифы).
Интересные корреляции были обнаружены между параметрами ферментации и некоторыми химическими характеристиками (табл. 2). В частности, коэффициенты корреляции между общим количеством пищевых волокон (TDF) и некоторыми параметрами ферментации давали высокие значения r (коэффициент корреляции) и были значимы для OMCV, A (p < 0,01) и Tmax (p < 0,05), в то время как содержание крахмала достоверно (p < 0,05) коррелировало с OMCV, А и Тmax. Полученное содержание белка и эфирного экстракта достоверно коррелировало с любым параметром ферментации.
Значение рН, определенное через 48 ч инкубации, оказалось особенно низким для кукурузы и инулина (4,52 и 4,72 соответственно) и достаточно высоким для чистой целлюлозы (7,06), а результаты достоверно (p < 0,01) коррелировали с концентрациями пропионата (r: −0,676) и изовалерата (r: 0,791).
Концентрации летучих жирных кислот достоверно коррелировали с параметрами химического состава, а доля углеводов влияла (p < 0,01 и p < 0,05) на продукцию ацетата и пропионата; сырой протеин и эфирный экстракт были связаны с образованием изобутирата, бутирата и валерата. Общее производство ЛЖК оказалось значительно (p < 0,01) выше для R, S, C и P (58,46, 58,00, 57,64 и 49,58 ммоль соответственно), чем для других субстратов, в основном из-за более высоких концентраций ацетата и пропионата.
Как и ожидалось, чистая целлюлоза давала самую низкую общую концентрацию ЛЖК (15,12 м), однако этот субстрат характеризовался более высокими концентрациями валериановой и изовалериановой кислот. Из-за недостатка доступных питательных веществ рост микроорганизмов снижается и даже может произойти лизис микроорганизмов. Интересно отметить, что общие значения ЛЖК для свекольного жома и пшеничных отрубей оказались выше, чем для инулина (I) и фруктоолигосахаридов (FOS), в результате высокой ферментируемости клетчатки свекольного жома и относительно высокого содержания крахмала в пшеничных отрубях (15,82% при кормлении). Низкая продукция ЛЖК FOS и I, вероятно, была вызвана недостатком азота в этих субстратах.
В конце ферментации инокулят, взятый у NM, продуцировал больше ЛЖК, чем инокулят представителей породы GS (47,51 против 38,78 ммоль; p < 0,01), и эти различия следует приписать исключительно пропионату, который у NM был примерно в два раза больше, чем у GS. С другой стороны, концентрации изомасляной, изовалериановой и валериановой кислот были достоверно (p < 0,01) выше у GS, чем у NM.
Инокулят GS характеризовался более быстрой начальной скоростью и более высокой газопродукцией по сравнению с NM. Интересно подчеркнуть, что инокуляты показали разные тенденции для всех субстратов, особенно для богатых крахмалом (C, S, P и R), хотя картофель и рис показали схожие формы кривых, но отличающиеся от таковых у кукурузы и спельты, вероятно, из-за различий в ферментируемости крахмала. Что касается свекольного жома (BP), чистой целлюлозы (PC) и пшеничных отрубей (WB), газовые профили двух пород были сходными, в то время как среди кормов формы кривых различались. Как и ожидалось, FOS и инулин давали сходные результаты.
Корреляции между параметрами ферментации и конечными продуктами: OMD значительно (p < 0,01) коррелировал с OMCV и соотношением между ацетатом и бутиратом (ЛЖК, которые больше участвуют в производстве газа) и пропионатом (ЛЖК, которые дают меньше газа). OMCV был достоверно (p < 0,01) связан со всеми рассматриваемыми параметрами.
Обсуждение и заключение
Газообразование и усвояемость органического вещества, зарегистрированные в течение48 ч с использованием инокулятов собак породы GS для чистой целлюлозы, FOS, инулина и пшеничных отрубей, соответствовали результатам предыдущего исследования (Cutrignelli, 2006), проведенного с использованием фекального инокулята собак той же породы. Высокая корреляция между углеводным составом (TDF и крахмал) и параметры in vitro подтверждают пригодность IVGPT для изучения характеристик ферментации кормов для собак.
Инокуляты показали низкую целлюлозолитическую активность, в обоих случаях чистая целлюлоза (PC) переваривалась лишь в минимальном количестве (Sunvold et al., 1995), в то время как процент OMD для фруктоолигосахаридов (FOS), инулина (I) и для субстратов, богатых крахмалом (картофель (P), спельта (S), кукуруза (C) и рис (R)), был высоким, что свидетельствует о высокой микробной активности в отношении неструктурных углеводов.
Однако различия, зарегистрированные между породами в параметрах ферментации, конечных продуктах и кинетике ферментации, предполагают разные пути ферментации углеводов, в частности для субстратов, богатых крахмалом, и подтверждают наблюдения исследователей (Simpson et al., 2002), обнаруживших существенные различия между породами по количеству отдельных аэробных и анаэробных бактерий.
Фекалии собак породы NM более интенсивно разлагали органические вещества (OM), но образование газа в процессе ферментации (OMCV, А) было ниже, чем в фекалиях собак породы GS. Однако более высокое разложение OM может относиться не только к белку, но и к различной утилизации неструктурных углеводов. Стоит отметить, что изомасляная, изовалериановая и валериановая кислоты образуются в результате бактериального метаболизма валина, лейцина и пролина соответственно. Следовательно, на одних и тех же ферментированных субстратах фекалии GS разлагали белки интенсивнее, чем фекалии NM. Незначительные взаимодействия между эффектами позволяют предположить, что инокуляты ведут себя одинаково, независимо от различий между субстратами. Действительно, фекальный инокулят NM кажется более способным использовать некоторые субстраты с высоким содержанием пропионата и, следовательно, с низким содержанием газа. Известно, что производство пропионата связано с более низким производством газа (СО2). На самом деле производство ацетата коррелирует с одной молекулой CO2 и одной молекулой H2, в то время как производство пропионата связано только с одной молекулой H2O. В данном случае взаимодействие было статистически значимым из-за особого поведения целлюлозы, которая демонстрировала обратную тенденцию по сравнению с другими субстратами, поскольку она была единственным очищенным субстратом. Как следствие, две породы сильно отличаются по способности к ферментации, вероятно, из-за различной микробной популяции/микробной активности.
Эти предварительные результаты можно считать первым шагом на пути к изучению активности микробиоты желудочно-кишечного тракта у собак с помощью метода выделения газа.
Полная версия статьи и список литературы: Ссылка.
vetpeterburg