Часть 1. Отбор и фиксация проб
Автор: Ганкина Ю. В., ветеринарный врач-патолог. Ветеринарная клиника неврологии, травматологии и интенсивной терапии, г. Санкт-Петербург.Думаю, многие примерно представляют, что гистология – это наука о тканях (все врачи проходили курс гистологии в вузах, но было это, чаще всего, достаточно давно). Соответственно, когда доктор отправляет какой-то материал на гистологическое исследование, он понимает, что исследовать будут ткани, которые он отправил. Казалось бы, все и так понятно, но тем не менее возникает множество вопросов как от направляющих материал врачей-клиницистов, так и от врачей-патологов.
Зачем писать направление? Что там писать (почему так много, неужели патологи сами не увидят в микроскопе, что я прислал)? Зачем столько формалина? Почему не подходит формалин с белым осадком, который у нас хранился с времен основания клиники? Почему не спирт? Почему так долго? Для чего нужны дополнительные окраски? Почему вы не делаете электронную микроскопию, хотя у вас есть компьютер? И многое, многое другое.
В серии своих статей я постараюсь ответить на некоторые вопросы врачей-клиницистов, объяснить, что же происходит с материалом после попадания в недра лаборатории и что патологи пытаются в нем рассмотреть.
Что оправляется на гистологическое исследование?
Первое, что приходит в голову, когда заходит речь о гистологии, – это опухоли (любые опухоли: кожные, внутренних органов, нервной системы, костей и пр.). Конечно, многие врачи предпочитают проведение цитологической диагностики перед хирургическим вмешательством, чтобы затем опираться на нее для определения типа неоплазии. Однако стоит помнить, что ряд неопластических процессов не может быть доподлинно определен при цитологическом исследовании. Зачастую такое исследование имеет погрешность (она может быть различной в зависимости от типа опухоли, ткани и учитываемых в исследовании критериев, согласно литературным источникам). Это касается и новообразований молочных желез, которые составляют большинство биоптатов. Причина в основном состоит в том, что для цитологического исследования предоставляется весьма небольшая часть материала.Только при гистологическом исследовании могут быть определены архитектоника тканей (в ряде случаев это является важной прогностической информацией), границы неопластического процесса, инвазия лимфатических сосудов и окружающих тканей, хотя некоторые типы новообразований можно с легкостью определить цитологически или цитологическое исследование может дополнять гистологическое (например, в случае мастоцитомы, а иногда – лимфомы и некоторых других).
Первый вопрос, на который должен ответить клиницист: «Что именно из всего операционного материала необходимо оправить на исследование?». Ведь иногда опухоли бывают очень большими, например большой орган или обширный пласт кожи, или, наоборот, очень маленькими. Встречаются идеальные условия, когда патолог находится в соседнем с операционной кабинете, что позволяет ему самому решать, с чем дальше иметь дело. В таком случае материал отправляется целиком, иногда даже до фиксации (допускается его охлаждение (не заморозка!) в течение 24 часов). Однако чаще всего отбором, фиксацией, вырезкой, нарезкой и микроскопией занимаются совершенно разные люди (хорошо, если они имеют возможность связаться друг с другом), поэтому важно знать основные правила отбора материала.
Основные правила отбора материала
Толщина образцов должна быть не более 1 см (иногда 2 см)- Если опухоль располагается в толще кожи, не содержит различимой капсулы, имеет умеренную плотность и диаметр до 1 см, такой образец можно отправить целиком.
- Если новообразование (даже небольшого размера – 1–2 см) очень плотной консистенции и имеет плотную капсулу, то фиксатор в него проникать будет тяжелее и дольше или только при определенной температуре. Это может привести к тому, что ткань в центре образца не профиксируется (что особенно важно в том случае, если он будет доставлен в лабораторию в срок, превышающий 1 сутки), поэтому такой образец следует надрезать, причем чем плотнее ткань, тем более тонкие фрагменты нужно получить. В случае, когда образец большой (орган целиком, например селезенка), его также стоит нарезать «книжечкой» на множественные фрагменты толщиной до 1 см (рис. 1).
- При опухолевых процессах часто имеются области некроза – обычно в центре неоплазии (но могут быть исключения). Данные фрагменты следует отбирать в последнюю очередь, а в первую очередь нужно брать участок без некроза, если таковой имеется. То же самое касается выраженного гнойного воспаления (если только оно не является основным изменением).
- При некоторых неопластических процессах стоит отправлять дренирующий лимфатический узел (молочные железы, некоторые новообразования конечностей). В таком случае этот узел необходимо отправить отдельно, так как постоперационно его может быть сложно обнаружить. Кроме того, не следует забывать, что, например, в одной молочной железе может быть несколько совершенно различных образований, поэтому (в зависимости от имеющейся возможности) либо железа отправляется целиком с указанием расположения образований, либо производится отбор нескольких образцов. В последнем случае каждый из образцов следует поместить в отдельные подписанные контейнеры, а в сопроводительном документе обязательно указать, сколько было отправлено образцов материала, какой это материал и количество контейнеров, поскольку неидентифицированный материал может быть расценен при вырезке как одно новообразование и часть проб в работу может не пойти.
Принципы оценки хирургических границ
Оценивать хирургические границы важно для определения прогнозов, возможности возникновения повторного роста новообразования. Многие клиницисты желают видеть эту информацию в заключении от патолога. Так ли все просто? Пожалуй, нет. Это сложная задача, в решении которой должны участвовать три составляющие гистологического процесса: врач, который отправляет материал, лаборант/врач/техник, который будет проводить вырезку материала, и патолог, который будет оценивать стекло.Вырезка – процесс, осуществляемый с фиксированным материалом в лаборатории для его последующей гистологической проводки, нарезки и фиксации. С этой целью отбираются кусочки малого размера (толщиной около 2–3 мм), позволяющего поместить их на стандартное предметное стекло.
Главная проблема заключается в предоставлении возможности участникам данного процесса контактировать друг с другом для достижения взаимопонимания.
Основные методы оценки хирургических границ:
- Метод поперечных срезов. Наиболее распространенный метод оценки хирургических границ (метод половин и четвертей). Для этого образец сначала разрезается по короткой оси, делаются срезы полученной области. Затем каждую половину разрезают по длинной оси, таким образом можно получить срезы новообразования в другой плоскости (это может быть один срез четверти новообразования либо несколько тангенциальных (по касательной) срезов в случае крупного образования) (рис. 2). Данный метод наиболее часто используется в рутинной практике, но с его помощью невозможно полностью оценить хирургические границы. Распространение опухоли может быть неравномерным, и клетки могут не попадать в срезы, полученные данным способом.
- Метод параллельных срезов. Подобно тому как материал нарезается для фиксации, образец нарезается на множественные фрагменты. Разрезы делаются параллельно, через равные промежутки (рис. 1). Таким образом, качество оценки хирургических границ напрямую зависит от количества таких разрезов, а увеличение этого количества может отражаться на стоимости исследования.
- Метод тангенциальных срезов. Множественные тонкие (2–3 мм толщиной) фрагменты отрезаются от края образца по касательной. При обнаружении неопластических клеток в таких образцах новообразование считается удаленным не полностью. Данный метод хорош и может быть более чувствительным, чем метод поперечных срезов, но он не позволяет оценить степень удаления края опухоли от хирургических границ. Для наиболее полной оценки предпочтительным является совмещение методов поперечных и тангенциальных срезов.
Для маркировки образцов можно применять красители, которыми удобно отмечать границы материала, поверхности, специальные участки. Они видны в гистологических препаратах и не влияют на качество окраски. Существуют специальные гистологические красители, но можно также использовать водостойкие чернила. Краски наносят специальными кисточками или ватными палочками, после чего им дают высохнуть в течение 5–10 мин. Далее материал необходимо поместить в фиксатор (от момента отбора материала до помещения его в формалин должно пройти не более 30 минут). Если образец крупный, после окраски и просушки его стоит разрезать. В направлении указывают, какими цветами отмечены те или иные границы/участки и пр. Применение красителей более предпочтительно, чем использование шовного материала разного цвета, с разным количеством стежков.
При отборе биоптатов из желудочно-кишечного тракта отбирают материал из места поражения. Не стоит брать биоптаты из других участков, т. к. они могут сильно отличаться от основного поражения, и в таком случае ответ на исследование может удивить клинициста. При эндоскопической биопсии осуществляют забор материала из слизистой оболочки стенки желудка или кишки с помощью специальных биопсийных щипцов. В идеале для получения адекватного образца ткани биопсийные щипцы надо, проведя через эндоскоп, ориентировать перпендикулярно слизистой органа. Как правило, эту процедуру достаточно легко выполнить в просвете желудка, но тяжело – в более узких участках, например в двенадцатиперстной кишке. В случае отсутствия специфических повреждений отбирают 6–8 образцов слизистой оболочки в области дна и тела желудка, несколько образцов антрального отдела. Если было обнаружено явное патологическое изменение, такому материалу отдают предпочтение в первую очередь.
При обнаружении язвенного поражения материал отбирают из периферии и центра (при этом нельзя допускать перфорации стенки). Несмотря на то что центральная часть язвы содержит некротическую ткань, диагностически значимые образцы могут быть получены и оттуда.
При выявлении поражений, лежащих глубже слизистой оболочки, можно применить технику, при которой осуществляют многократный забор материала из одного и того же места, углубляясь в стенку и достигая таким образом патологического очага (хотя в этом случае полнослойный забор более предпочтителен).
Биоптаты слизистой оболочки тонкой кишки должны быть достаточно глубокими, чтобы в образце содержались ворсинки на всю длину и область крипт. Следует помнить, что при отборе очень плотного материала образцы могут иметь слишком мелкий размер и быть сильно подвержены артефактам от травмирования браншами щипцов (артефакты сдавливания). По рекомендациям Международной ветеринарной ассоциации мелких домашних животных (the World Small Animal Veterinary Association; WSAVA), в гистологическом описании следует указывать качество образцов для того, чтобы клиницист понимал, насколько точен диагноз и насколько правильно он проводил отбор материала.
Гистологическое исследование аутопсийного материала – последнее, по упоминанию у врачей, но не по значимости. «Человек, не прошедший специальную подготовку по ветеринарной патологии, не должен осуществлять вскрытие с идеей о том, что диагноз будет поставлен во время вскрытия» («A person not specially trained in veterinary pathology should not approach a necropsy with the idea that a diagnosis will be made during the post-mortem examination»; Terrell and Stacy, 2007). Зачастую диагноз не может быть доподлинно установлен до тех пор, пока не будет проведено гистологическое исследование. Материал в таком случае отбирается врачом-патологом. Следует помнить о правилах фиксации (см. далее) и толщине образцов. Как правило, весь материал от одного животного помещается в один контейнер. Некоторые органы фиксируются целиком: головной и спинной мозг (исключение составляют крупные животные, головной мозг которых может быть разрезан на 2–3 крупные части). Мелкие органы: гипофиз, надпочечники, щитовидные железы и пр. – помещают в гистологические кассеты, чтобы избежать утери (рис. 3). При отборе полых органов стоит ввести фиксирующую жидкость в просвет или разрезать его, оставив при этом область интереса интактной. Плоские фрагменты (стенка мочевого пузыря, диафрагма, стенка желудка) могут скручиваться, поэтому их нужно поместить на адсорбирующую подложку. Это может быть поролоновая подложка для гистологических кассет, если образец небольшого размера, или картон при наличии образцов крупного размера (материал просто кладут на подложку, при этом не требуется дополнительной фиксации иглами, швами) (рис. 4). При отборе мышц важно зафиксировать мышечные волокна, так как в процессе химической фиксации мышцы будут сжиматься, что скажется на дальнейшем микроскопическом виде, поэтому мышцы обязательно фиксируют на картонной или деревянной подложке (ею может быть деревянный шпатель) с помощью игл или специальных мышечных зажимов.
После того как ткань перестала «жить» (отдельно от организма, без специальных условий ткани существовать не могут), она начинает подвергаться разрушению под действием собственных ферментов и бактерий, поэтому, чтобы материал сохранился, его необходимо зафиксировать. Фиксация должна проводиться сразу после отбора (исключением может служить срочное гистологическое исследование замороженного материала, о чем речь пойдет позже, в таком случае проводится фиксация охлаждением). Наиболее частым методом фиксации является химическая фиксация с помощью различных веществ. Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, в связи с этим фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Слишком продолжительная фиксация приводит к значительному уплотнению материала, что в дальнейшем затрудняет его обработку (к вопросу о бессрочном хранении зафиксированного материала).
Рассмотрим некоторые фиксаторы:
- Этиловый спирт – этот фиксатор иногда пытаются использовать при отсутствии других химических веществ. Быстро фиксирует ткани, осаждает белки, вымывает жиры, иногда применяется для выявления гликогена, железа, амилоида. Главным его недостатком является сильное пересушивание и уплотнение тканей, поэтому фиксация в спирте не должна превышать одних суток. Также стоит учитывать, что дальнейшая проводка после фиксации спиртом будет несколько отличаться от таковой при фиксации формалином, поэтому всегда нужно уточнять, является ли фиксация этиловым спиртом или другими фиксаторами на его основе приемлемой в вашей лаборатории.
- Специальные фиксирующие жидкости:
- Фиксатор Буэна используется чаще в экспериментальной патологии. Содержит пикриновую кислоту, окрашивающую образец, что в дальнейшем не мешает работе с ним. Продолжительность фиксации составляет 1–24 часа, после чего материал отмывают и переносят в спирт.
- Фиксатор Дэвидсона. Содержит формалин, этанол и ледяную уксусную кислоту. Приводит к быстрому обесцвечиванию тканей, что затрудняет дальнейшую работу с ними. Фиксация не должна превышать 24 часов. Используется в экспериментальной патологии, хорошо подходит для фиксации глаз лабораторных грызунов.
- Формалин (водный раствор формальдегида, стабилизированный метанолом) – самый недорогой и наиболее широко применяемый фиксатор. Используется 10%-й нейтральный забуференный формалин (указывается только процентное соотношение формальдегида). Если в требованиях лаборатории не указан другой фиксатор, то всегда для гистологического исследования используют именно его. В водных незабуференных растворах формальдегид со временем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые ухудшают качество фиксации, как и выпадение белого осадка параформальдегида. Кроме того, забуференный формалин лучше сохраняет антигенные свойства ткани. Не стоит забывать, что формалин имеет резкий специфический запах, раздражает слизистые оболочки, является канцерогеном, поэтому любые работы с зафиксированными тканями должны проводиться только в перчатках и исключительно в вытяжном шкафу. При одновременном отборе материала для гистологического и цитологического исследований не следует подвергать стекла с цитологией действию паров формалина, необходимо максимально разделить нахождение этих двух типов материала. Длительность фиксации составляет 24–48 часов при комнатной температуре.
Соотношение объема фиксатора и фиксируемой ткани должно быть не менее 1:10–1:20.
Чаще всего объем жидкости лимитирован размерами тары (рис. 5), поэтому при отборе материала убедитесь, что подобранная тара имеет подходящий объем, который обычно указан на упаковке (объем образца можно оценить визуально, сравнить с объемом шприцев и пр.). Проследите, чтобы крышка банки была плотно закрыта. Не используйте банки с узким горлышком, т. к. после фиксации материал становится плотным и не может быть извлечен из таких емкостей (банку в подобных случаях разбивают или разрезают). Стеклянная тара не всегда идеальна, поскольку может разбиться при транспортировке. Контейнер можно положить в полиэтиленовый пакет (пакеты для продуктов с зажимом или специальные пакеты для биопроб), чтобы предотвратить вытекание фиксатора и загрязнение окружающих предметов. Обязательно нужно проследить за тем, чтобы проба при транспортировке не замерзла (если велика вероятность замерзания, к формалину можно добавить изопропиловый спирт из расчета 1 часть спирта к 10 частям формалина). Замерзание образца приводит к нарушению структуры ткани и часто к невозможности оценить ее гистологически, поэтому размороженные образцы не подходят для гистологического исследования.
При фиксации нужно проследить, чтобы органы, размещенные на дне или у края контейнера, профиксировались целиком (поверхность, обращенная к дну, может прилипнуть и не зафиксироваться, чтобы избежать этого, материал стоит встряхнуть или «отклеить» от дна). При фиксации сильно кровенаполненных органов (например, селезенки) кровь будет разбавлять фиксатор, поэтому требуется больший объем фиксатора или предпочтительнее сделать отмывание органа. Для этого орган помещается в соответствующий объем фиксатора (1:10, как обычно), но через 12 часов фиксатор меняют на новый.
Выводы
Информация, которая указана в данной статье, достаточно проста, но, к сожалению, врачи очень часто пренебрегают важными правилами, приведенными ниже, что делает исследования менее информативными.- Материал должен быть зафиксирован сразу после отбора пробы (в срок до 30 минут).
- Для фиксации следует использовать только 10%-й нейтральный забуференный формалин (если лабораторией не указано использование другого фиксатора).
- Толщина образца не должна превышать 1–2 см (используйте линейку для измерения толщины образцов).
- Соотношение «ткань-фиксатор» должно составлять 1:10–1:20.
- Не нужно замораживать образцы для гистологического исследования.
Литература:
- Washabau R. J., Day M. J., Willard M. D., Hall E. J., Jergens A. E., Mansell J., Minami T. and Bilzer T. W. Endoscopic, Biopsy, and Histopathologic Guidelines for the Evaluation of Gastrointestinal Inflammation in Companion Animals. The WSAVA International Gastrointestinal Standardization Group. ACVIM Consensus Statement, J Vet Intern Med. 2010; 24:10–26.
- Sontas B. H., Yüzbaşıoğlu Öztürk G., Toydemir T. F., Arun S. S., Ekici H. Fine-needle aspiration biopsy of canine mammary gland tumours: a comparison between cytology and histopathology. Reprod Domest Anim. 2012 Feb; 47(1): 125–30.
- Handbook of small animal gastroenterology, 2003.
- Day M. J., Bilzer T., Mansell J., Wilcock B., Hall E. J., Jergens A., Minami T., Willard M. and Washabau R. Histopathological Standards for the Diagnosis of Gastrointestinal Inflammation in Endoscopic Biopsy Samples from the Dog and Cat: A Report from the World Small Animal Veterinary Association Gastrointestinal Standardization Group. J Comp Path. 2008, Vol. 138, S1eS43.
- Jubb, Kennedy, and Palmer’s pathology of domestic animals / edited by M. Grant Maxie. 6th Edition, 2016.
- Kamstock D. A., et al. Recommended Guidelines for Submission, Trimming, Margin Evaluation, and Reporting of Tumor Biopsy Specimens in Veterinary Surgical Pathology. Veterinary Pathology. 48(1) 19–31.
- Todd R. Tams, Clarence A. Rawlings. Small Animal Endoscopy, 3rd Edition, 2011.
- Jоrg M. Steiner (ed.). Small Animal Gastroenterology, 2008.
- Kiupel M. (ed.). Surgical pathology of tumors of domestic animals. Volume 1: Epithelial tumors of the skin, 2018.
vetpeterburg