Коронавирусы собак и кошек: генетика, жизненный цикл и проблемы диагностики

Коронавирусы способны заражать многие виды животных и человека. Эти вирусы были описаны более чем 50 лет назад (описание мышиного коронавируса датировано 1949 г.)

Таксономия. Свое название коронавирусы получили в 1968 г. из-за коронаобразного внешнего вида, описанного по фотографиям, сделанным при проведении электронной микроскопии. В 1975 г. семейство Coronaviridae было зарегистрировано Международным комитетом по таксономии вирусов. Семейство Coronaviridae подразделяется на 2 подсемейства: коронавирусы и торовирусы. Последние вызывают кишечные заболевания у коров и, возможно, у людей. Коронавирусы включают три рода (I-III), это разделение изначально было основано на серологических перекрестных реакциях, а более поздние молекулярно-генетические исследования подтвердили его. В группу I входят патогены животных, такие как коронавирус свиней, вирус инфекционного перитонита кошек, а также коронавирусы человека, вызывающие респираторные заболевания. Группа II также включает патогены ветеринарного значения, такие как BCoV, гемагглютинирующий вирус энцефаломиелита свиней, коронавирус лошадей, а также человеческие коронавирусы, вызывающие респираторные инфекции. Также в эту группу входят вирусы, которые инфицируют мышей и крыс. В группу III на сегодняшний момент входят только коронавирусы птиц.
Морфология. Коронавирусы представляют собой оболочечные вирусы с округлыми и иногда плеоморфными вирионами диаметром приблизительно 80-120 мкм. Эти вирусы содержат РНК с самым большим РНК-геномом (приблизительно 30 т.п.о.), известным на сегодняшний день. Геномная РНК образует комплексы с основным белком нуклеокапсида, в результате чего формируется спиральный капсид, находящийся внутри вирусной мембраны. Мембраны всех коронавирусов содержат по меньшей мере три вирусных белка. Это так называемые spike (S), гликопротеин I типа, образующий пепломеры на поверхности вириона, придающие коронаобразную морфологию вирусу; мембранный (М) белок и маленький мембранный белок (Е).

Геном всех коронавирусов обладает одинаковой структурой. На 5’ конце 20-22 т.п.о. содержат ген репликазы, в котором закодированы многочисленные ферментативные активности. Продуктами этого гена являются два больших полипептида, pp1a и pp1ab. Структурные белки закодированы на 3’ конце генома и занимают одну треть от всего генома.
Жизненный цикл вируса. Коронавирусы, попав в организм, контактируют со специфическими клеточными рецепторами хозяина с помощью своего spike-белка. Это запускает изменения структуры spike, что в свою очередь приводит к слиянию между вирусной и клеточной мембраной, а это заканчивается введением нуклеокапсида в клетку хозяина. При проникновении в клетку хозяина начинается активная трансляция гена репликазы на рибосомах в цитоплазме. Получающиеся многочисленные ферменты, как считается, играют роль в метаболизме РНК коронавируса и/или во взаимодействии с процессами, происходящими в клетке хозяина.
При инфицировании коронавирусами, так же как и для всех остальных РНК- содержащих коронавирусов, должна происходить репликация генома вируса и транскрипция РНК. Репликация генома вируса включает синтез полноразмерной отрицательной нити РНК, которая присутствует в низкой концентрации и служит матрицей для полноразмерной геномной РНК. После трансляции всех вирусных белков собирается нуклеокапсид вируса, который одевается оболочкой. Затем вирусные частицы транспортируются на поверхность клетки, где они покидают клетку.

Роль белков коронавируса в патогенезе Spike. С помощью spike-белка коронавирусы прикрепляются к специфическим клеточным рецепторам. Это запускает изменения структуры spike, что в свою очередь приводит к слиянию между вирусной и клеточной мембраной. Spike-белок коронавируса играет существенную роль в проникновении вируса в клетку, распространении от клетки к клетке, а также определяет тропизм к ткани. Способность коронавируса реплицироваться в определенных типах клеток зависит только от способности взаимодействовать с рецепторами этого типа клеток. Также было показано, что spike является главной детерминантой патогенности.
Мембранный белок. М-белок является основным белком мембраны вириона. Считается, что М-белок, кроме выполняемой им роли в сборке вирусных частиц, влияет на взаимодействие с клеткой хозяина. Белок нуклеокапсида. Является структурным белком, но также принимает участие в транскрипции и патогенезе. Экспрессия N-белка необходима для эффективного образования вирусных частиц из копий ДНК. Маленький белок оболочки. Е-белок является интегральным мембранным белком. Вместе с М-белком он играет важную роль в сборке вирусных частиц. Возможно, из-за активности катион-селективного ионного канала он может усиливать интенсивность вирусного морфогенеза и сборку вирусных частиц. Предполагается, что Е-белок играет роль во взаимодействии вируса и клетки хозяина, индуцируя апоптоз. Белки-репликазы. Эти белки способны влиять на тропизм и патогенез с помощью определения степени вирусной репликации, возможно, через взаимодействие с некодирующими последовательностями вирусного генома, специфическими факторами клеточных типов или с факторами иммунного ответа. Некоторые ферментативные активности могут быть вовлечены в разрушение многих аспектов метаболизма клетки хозяина.

Коронавирусная инфекция кошек

Коронавирусы кошек (FCoVs; семейство Coronaviridae, порядок Nidovirales) представляют собой важные патогены кошек. Они существуют в виде двух разных патотипов. Кишечный коронавирус кошек (FECV) является обычным патотипом, который, как кажется, инфицирует только кишечный тракт и вызывает слабый, часто сложно идентифицируемый энтерит. Вирус эффективно распространяется через зараженные фекалии, и инфекция может проходить бессимптомно в течение года или более (Chang et al., 2010). Частота встречаемости FECV очень высока, достигает до 90% в больших скоплениях кошек по данным, полученным при исследовании сыворотки. Другой патотип, которым был назван вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV), возникает только от случая к случаю. Он развивается менее чем в 10% случаев у серопозитивных животных (Brown et al., 2009). В противоположность FECV, FIPV является плохо передающимся и высоковирулентным. Путем эффективного инфицирования макрофагов и моноцитов FIPV может вызывать летальное системное заболевание, вовлекающее многие органы, и в классических случаях сопровождающееся накоплением брюшного экссудата (или асцита).
Специфические генетические детерминанты такого исхода болезни все еще не описаны. На настоящий момент не существует эффективного лечения, вакцины или диагностического протокола, который помог бы разделить авирулентный FECV и FIPV. Генетические вирусные факторы, гипотетически связанные с патогенезом FIPV, уже описаны. Гипотеза мутации in vivo постулирует, что происходит мутация de novo, которая и дает начало вирулентности. Точная природа мутации, отвечающей за патогенез, не была идентифицирована, хотя в опубликованных исследованиях были выдвинуты предположения о различиях в последовательностях spike-белка, а также неструктурных белках 7b и 3с, как детерминантах заболевания (Brown et al., 2009). Также есть данные, что геном коронавирусов, которые способны приводить к инфекционному перитониту, был короче приблизительно на 300 п.о. . После проведения исследований in vitro, описывающих аффинность к макрофагам штаммов FIPV в противоположность штаммов FECV, гипотеза была расширена до предположения, что в геноме кишечного коронавируса (FECV) происходит мутация в желудочно-кишечном тракте, которая дает возможность ему инфицировать макрофаги, распространяться по всему организму и, следовательно, приводить к развитию смертельного заболевания. Однако попытки использовать химерные вирусы, созданные с помощью методов биоинженерии, чтобы идентифицировать вирулентные детерминанты, не увенчались успехом (Haijema et al., 2003). Более того, FCoVs, обнаруженные в различных тканях кошек, зараженных коронавирусом, но у которых инфекция не проявлялась, были неразличимы (Brown et al., 2009).
Гипотеза мутации in vivo патогенеза FIPV широко цитируется, хотя она не была точно подтверждена. Альтернативная гипотеза существования вирулентных и авирулентных штаммов вирусного патогенеза предполагает наличие различных неопасных и патогенных штаммов FECV, присутствующих в популяции, а также прогнозирует развитие заболевания только у тех животных, которые заражены вирулентным штаммом. Также в литературе можно встретить сведения, что вирус может присутствовать не только в кишечнике, но и в других органах клинически здоровых животных.

Диагностика кошачьего коронавируса

Инфекция, вызванная FECV, обычно связана с умеренным заболеванием. Во многих случаях она остается бессимптомной, а у котят проявляется в виде слабой диареи продолжительностью несколько дней. Вирус можно обнаружить в фекалиях больных котят путем электронно-микроскопического исследования или с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой. У многих клинически здоровых взрослых кошек и котят вирус также присутствует в фекалиях. Таким образом, обозначенные выше способы могут выявить животных-носителей.FIPV вызывает смертельный перитонит. У кошек со слабым клеточным иммунным ответом развивается так называемая «влажная» форма заболевания, которая заключается в развитии васкулита, вызывающего просачивание жидкости, обогащенной белками, в брюшную полость, что приводит к вздутию живота. У кошек с частичным клеточным иммунным ответом может развиться «сухая» форма, характеризующаяся пиогрануломатозными и пролиферативными повреждениями множества тканей. Сухая форма инфекционного перитонита может перейти во влажную форму на конечных стадиях заболевания при коллапсе иммунной системы (Sharif et al., 2010).
Прижизненная диагностика FIP (Feline infectious peritonitis) сложная и разочаровывающая. Трудности постановки точного диагноза заключаются в отсутствии специфических клинических признаков, характерных для данного заболевания биохимических аномалий, а также низкой чувствительности тестов, рутинно использующихся на практике. Постановка диагноза FIP основана на сопоставлении анамнеза, гематологии, а также других диагностических тестов, включая серологические исследования, микроскопию биоптатов и ПЦР (Sharif et al., 2010).

Основные диагностические тесты

Наиболее важным биохимическим показателем при FIP является повышение общей концентрации белка в сыворотке. Это обнаруживается приблизительно у 50% кошек с «влажной» формой и у 70% кошек с «сухой» формой заболевания. Повышение общего белка вызывается повышением концентрации глобулинов, в основном g-глобулинов. Концентрация g-глобулина, составляющая более 32%, является характеристикой FIP (Sharif et al., 2010). Изменения в профиле сывороточных белков приводят к понижению соотношения альбумина к глобулину. Соотношение A:G менее 0.5 сильно коррелирует с FIP (Sharif et al., 2010).
Для диагностики FIP важно отобрать асцитную жидкость, поскольку ее исследование имеет большее диагностическое значение, чем исследование крови. Присутствие этой жидкости в организме само по себе не является диагностическим. Экссудат, наблюдаемый при FIP, классифицируют как модифицированный транссудат или экссудат с очень высоким содержанием белка (>3,5 г/дл) и умеренным содержанием клеток. Асцит можно исследовать с использованием простой и недорогой реакции Ривальта (несколько капель асцита капают в пробирку с дистиллированной водой, а затем туда добавляют каплю 8%-ной уксусной кислоты, что приводит к выпадению осадка при повышенной концентрации белка в асците). Этот тест полезен для выявления различий между выделениями, вызванными FIP, и выделениями, вызванными другими заболеваниями. Однако у кошек с перитонитом бактериальной природы могут быть получены ложноотрицательные результаты, а у кошек с лимфомой этот тест может привести к ложноположительным результатам (Sharif et al., 2010).
При цитологическом исследовании асцитной жидкости кошек с FIP обнаруживаются макрофаги и нейтрофилы в плотном, похожем на белок субстрате. У нейтрофилов могут проявляться слабые дегенеративные изменения ядра. Также в асцитной жидкости могут быть обнаружены лимфоциты и плазмоциты.

Серология

Измерение уровня антител в сыворотке является важным диагностическим инструментом для обнаружения FCoV. Однако, поскольку большой процент здоровых кошек обладает антителами к FCoV, тестирование на наличие антител скорее помогает при мерах по избавлению от инфекции, вызванной FCoV (например, выведения из питомника зараженных животных).
Исследование уровня антител у кошек, которые предположительно больны FIP, обладает ограниченным значением для подтверждения диагноза, и результаты следуетинтерпретировать с осторожностью. У некоторых кошек с влажной формой FIP наблюдаются низкие титры или даже полное отсутствие антител к FCoV. Это происходит из-за того, что большое количество вируса в организме кошки связывается с антителами и делает их недоступными для антигена или из-за того, что антитела отсутствуют в асцитной жидкости. Использование анти-7b белков для серологических исследований не имеет какого-либо значительного преимущества.
Поскольку FIP является заболеванием, опосредованным иммунной системой, комплексы антиген-антитело могут циркулировать в сыворотке и асците. Циркулирующие комплексы можно обнаружить с помощью конкурентного ИФА. Однако ценность этого исследования ограничена, поскольку прогностичность положительного результата невысока (67%) и наблюдается очень много ложноположительных результатов (Sharif et al., 2010).

Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (RT-PCR) Существует множество публикаций, в которых описано обнаружение FCoV с помощью RT-PCR. Некоторые авторы используют праймеры, комплементарные консервативным участкам вирусного генома, таким как Pol, ген 7b, а также 3' нетранслируемый участок (3' UTR). Тесты RT-PCR, в которых используются такие праймеры, способны обнаружить большинство, если не все штаммы FCoV, и являются значимым инструментом для скрининга вируса в популяциях кошек. В связи с тем что последовательность гена S различается у серотипов I и II, некоторые тест-системы RT￾PCR конструируют таким способом, чтобы различить эти серотипы FCoV.
Поскольку специфические генетические детерминанты биотипов FCoV неизвестны и геном содержит различные однонуклеотидные замены (SNPs), невозможно создать праймеры для ПЦР, с помощью которых можно различать FIPV и FECV и таким образом определять случаи FIP- и FCoV-положительных здоровых кошек. Тест-системы ПЦР, которые используются для обнаружения FCoV в образцах фекалий, являются и чувствительными, и полезными для информации, что у кошки в кишечнике присутствует FCoV. Интенсивность сигнала RT-PCR в фекалиях коррелирует с количеством вируса, присутствующего в кишечнике. Сравнения между образцами РНК, выделенными из суспензии фекалий и суспензии культивированных FCoV- инфицированных клеток, продемонстрировали наличие в фекалиях факторов, которые ингибируют реакцию обратной транскрипции.
Вирус может быть обнаружен в различных тканях и асцитной жидкости. Как считается, наиболее вероятно обнаружение FCoV в печени (48%) и селезенке (42.3%), чем в почках (21.1%). Вдобавок количество РНК, выделенное из свежих тканей, значительно выше, чем из тканей, зафиксированных формалином, этанолом или раствором Буэна. Было обнаружено, что праймеры, сконструированные таким способом, чтобы обнаруживать FIP у больных кошек, способны амплифицировать FCoV у здоровых кошек. Таким образом, результаты RT-PCR следует интерпретировать в соответствии с клиническим статусом кошки, и ПЦР нельзя использовать как единственный тест для диагностики FIP. Существует несколько правдоподобных объяснений ложноотрицательных результатов RT-PCR, включая деградирование РНК, непрохождение реакции обратной транскрипции, а также различия в нуклеотидных последовательностях FCoVs. Инфицирование CCV (коронавирус собак) или TGEV также может объяснить ложноположительные результаты, поскольку эти вирусы обладают высококонсервативными участками.

Гистопатология и иммуноцитохимия

Гистопатологическое подтверждение FIP используют для диагностики этогозаболевания, и гистопатологические техники считаются «золотым стандартом» диагностики. На срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, обычно наблюдаются локализованные очаги воспаления с макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами и плазмоцитами. Могут быть обнаружены повреждения сосудов, окруженные пролиферирующими воспалительными клетками, это является характерным для влажной формы FIP. Пиогранулемы в основном связаны с фибринозным некрозом, они могут быть большими и объединенными или многочисленными и маленькими. Очаговые накопления воспалительных клеток и некротических пролиферативных повреждений типичны для пролиферативных повреждений сухой формы FIP.
Иммуногистохимическое тестирование, такое как окрашивание пероксидазой, может не обнаружить антиген FCoV в ткани. С помощью иммуноокрашивания невозможно различить FECV и FIPV, однако, поскольку FIPV реплицируется более активно, при случаях FIP обнаруживаются более высокие концентрации вирусного антигена (Sharif et al., 2010). Концентрации вирусного антигена более низки в повреждениях у кошек с сухой формой FIP, чем у кошек с влажной формой FIP (Sharif et al., 2010).

Коронавирусная инфекция собак

Коронавирусный энтерит собак. В настоящее время известно 2 генотипа коронавируса, вызывающего энтерит у собак, CCoV-I и CCoV-II. Гомология этих генотипов составляет 96%, однако у них весьма различаются последовательности гена белка spike. Проведенный анализ выявил, что оба этих генотипа одновременно присутствуют в кишечнике зараженной собаки. В 2005 г. в Италии был описан высоковирулентный пантропический штамм CCoV-II, вызывающий в отличие от обычных генотипов системное заболевание, сопровождающееся летаргией, потерей аппетита, рвотой, кровавой диареей, тяжелой лейкопенией и неврологическими симптомами с последующей смертью через два дня после проявления симптомов. Вскрытие показало наличие тяжелых обширных повреждений легких, печени, селезенки и почек. Респираторный коронавирус собак. Идентифицирован в 2003 г. в респираторном тракте собак из английского питомника. Наиболее близок к бычьему коронавирусу, а гомология с кишечным коронавирусом собак составляет всего 21%. Заражение этим коронавирусом вызывает умеренные респираторные симптомы. Вирус является одним из этиологических агентов питомникового кашля.

Список использованной литературы:

Meredith A. Brown, Jennifer L. Troyer, Jill Pecon Slattery et al., 2009. Genetics and Pathogenesis of Feline Infectious Peritonitis Virus. Emerging Infectious Diseases 15, 9:1445- 1452.
Chang H.-W., de Groot R. J., Egberink H. F. 2010. Feline Infectious Peritonitis: insights into feline coronavirus pathobiogenesis and epidemiology based on genetic analysis of the viral 3c gene. Journal of General Virology, 91:415-420.
Decaro N., Mari V., Elia G. et al., 2010. Recombinant Canine Coronaviruses in Dogs, Europe. Emerging Infectious Diseases, 16, 1:41-47.
Haijema B. J., Volders H., Rottier P. J. 2003. Switching species tropism: an effective way to manipulate the feline coronavirus genome. J. Virol., 77: 4528-4538.
Pratelli A. 2011. The Evolutionary Processes of Canine Coronaviruses. Advances in Virology.
Sharif S., Arshad S. S., Hair-Bejo M. et al., 2010. Diagnostic Methods for Feline Coronavirus: A Review. Veterinary Medicine International: 1-7.
Susan R. Weiss and Sonia Navas-Martin. 2005. Coronavirus Pathogenesis and the Emerging Pathogen Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Microbiology and Molecular Biology Reviews 69, 4: 635-664.

Автор:  Крылова Д. Д.
Рубрика:  Лабораторные исследования

Любите читать бумажную версию? Живёте далеко? Не беда!

Оформить рассылку

Эксклюзив для ветеринарных клиник Санкт-Петербурга

Оформить доставку