Метод анализа кривых плавления ДНК и его использование в диагностике заболеваний

Автор: Крылова Дарья Дмитриевна, молекулярный биолог, заведующая отделением ПЦР диагностики независимой ветеринарной лаборатории "Поиск", г. Санкт-Петербург.

Метод анализа кривых плавления ДНК (High Resolution Melting Point Analysis (HRM)) – это новый метод анализа последовательности ДНК, внедренный в 2002 г. в США. Его популярность как простейшего метода для генотипирования, обнаружения мутаций и различий в последовательности ДНК быстро растет. Для проведения такого анализа не требуется какой-либо особенной подготовки или обработки образца. После обычной амплификации за счет флуоресценции насыщающего красителя, который не ингибирует полимеразную цепную реакцию (ПЦР), генерируются кривые плавления ДНК.
Первым этапом протокола HRM является амплификация интересующего участка с использованием стандартной техники ПЦР в присутствии специализированного красителя, связывающегося с двухцепочечной ДНК (дцДНК). Этот специализированный краситель испускает сильное свечение, когда связан с дцДНК, и не светится в несвязанном состоянии. Это изменение позволяет пользователю отслеживать накопление продукта ПЦР в реальном времени. Краситель добавляется в реакционную смесь до начала проведения ПЦР, поэтому никаких дополнительных манипуляций с образцами и пробирками производить не нужно, что снижает риск контаминации.
После завершения стадии ПЦР накопленный продукт (большое количество копий интересующего нас участка ДНК) постепенно нагревают, при этом двухцепочечный накопленный продукт денатурирует, т. е. разделяется на одиночные нити ДНК. Краситель, связанный с двухцепочечной ДНК, при этом отделяется, и свечение исчезает. В какой-то момент при определенной для каждого фрагмента температуре наступает состояние, при котором половина всей ДНК в системе остается двухцепочечной, а половина разделяется на две отдельные цепи, постепенно денатурируется при повышении температуры с маленьким шагом, чтобы образовался характерный профиль плавления. Эта температура называется температурой плавления (Tm) дуплекса ДНК, и она является характеристикой содержания в дуплексе ГЦ пар, длины и последовательности, также она является температурой, при которой нормализованная флуоресценция составляет 50%. Температура эта является уникальной, и различия в этой температуре позволяют сделать вывод о структуре накопленного продукта ПЦР. При правильной организации протокола анализ кривых плавления является очень чувствительным методом, позволяя обнаружение замены одного нуклеотида в остальном идентичных последовательностях.
При проведении анализа кривых плавления ДНК используются достаточно дешевые красители и требуется менее серьезная оптимизация, чем для аналогичных систем, использующих меченые зонды (так называемые TaqMan пробы). По сравнению с этими методами HRM является более простым и менее затратным способом охарактеризовать многочисленные образцы.

Анализ кривых плавления можно применять для:

– генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotides Polymorphisms – SNP);
– описания мутаций (генного сканирования);
– картирования ДНК;
– идентификации видов;
– исследования разнообразия в популяциях вирусов/бактерий и т. д.

Анализ кривых плавления позволяет генотипирование без наличия меченых проб, даже если последовательности различаются всего по одному нуклеотиду. Рассмотрим вариации А>С с возможными генотипами А/А, А/С и С/С (рис. 1А).

Рис. 1А. Различия, выявляемые при проведении анализа кривых плавления.
Если получить короткий продукт ПЦР с помощью праймеров, ограничивающих изменчивый участок нуклеотидной последовательности, все три генотипа можно легко различить. Кривые А/А и С/С сходны по форме, но температура плавления (Tm) гомозиготы С/С приблизительно на 1°C выше, чем Tm гомозиготы А/А. Кривая плавления гетерозиготы А/С отличается по форме от кривых плавления гомозигот. Разница между генотипами заметна сильнее при анализе коротких ампликонов. Преимущества способа: быстрота и дешевизна.
Метод анализа кривых плавления ДНК широко используется для диагностики наследственных заболеваний человека, обусловленных однонуклеотидными заменами, короткими мутациями и метилированием ДНК. В ветеринарной медицине анализ кривых плавления для этих целей пока применяется гораздо реже, и его использование практически ограничено только определением различных штаммов микроорганизмов, например Ch. Ch. psitacci (Mitchell et al., 2009), Mycoplasma sp. (Rebelo et al., 2011), различных кровепаразитов (Kelly et al., 2013) и т.д. У мелких домашних животных (мы говорим в основном о собаках и кошках) описано множество наследственных заболеваний (например, кардиомиопатия мейн-кунов, обусловленная заменой нуклеотида G на С во втором экзоне гена MYBPC3, кардиомиопатия рэгдоллов, обусловленная заменой других нуклеотидов в этом же гене, первичный вывих хрусталика определенных пород собак и т.д.), диагностика которых в настоящее время проводится методом секвенирования последовательности ДНК. Конечно, этот метод является высокоточным, и его необходимо использовать как референсный при возникновении каких-либо спорных ситуаций, но также такой анализ является достаточно дорогостоящим. Анализ кривых плавления ДНК, хотя и не может всегда заменить прямое определение последовательности ДНК, при правильной и точной отработке методики во многих случаях ничем не уступает прямому определению последовательности генетического материала путем секвенирования и при этом гораздо более дешев, а также требует гораздо меньше времени для проведения анализа.

Литература:

  • Gregory R., Karin D. E. Everett, Branson W. Ritchie, and Jonas M. Winchell. Genotyping of Chlamydophila psittaci by Real-Time PCR and High-Resolution Melt Analysis. Journal of Clinical Microbiology, Jan. 2009, p. 175–181.
  • Kelly P. J., Xu C., Lucas H., Loftis A., Abete J., et al. (2013) Ehrlichiosis, Babesiosis, Anaplasmosis and Hepatozoonosis in Dogs from St. Kitts, West Indies.
  • Ana Rita Rebelo, Lois Parker, Hugh Y. Cai. Use of high-resolution melting curve analysis to identify Mycoplasma species commonly isolated from ruminant, avian, and canine samples. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 23(5) 932–936.
  • Reed et al. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics (2007) 8(6), 597–608.
  • Wittwer C. T., Kusukawa N. Nucleic acid techniques. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics (4th Edition). Burtis C, Ashwood E, Bruns D (Eds.). Elsevier, New York, NY, USA, 1407–1449 (2005).

Автор:  Крылова Д. Д.
Рубрика:  Лабораторные исследования

Любите читать бумажную версию? Живёте далеко? Не беда!

Оформить рассылку

Эксклюзив для ветеринарных клиник Санкт-Петербурга

Оформить доставку